Nel 1831 rimase coinvolto nei moti liberali e perse quindi la cattedra al momento della restaurazione del governo pontificio. Dopo che gli fu impedito di aprire una propria scuola medica, nel 1834, si trasferì in Toscana dove, assieme a studi di carattere umanistico sul Trecento, poté esercitare liberamente la professione. Negli anni fra il 1835 e il 1840 giunse a definire compiutamente il concetto di 'medicina civile' ("Del carattere civile della medicina", Pisa, Nistri, 1839) e si dedicò all'analisi delle malattie nervose ("Lezioni sulle malattie nervose", Firenze, Ricordi e Compagno, 1834 e "Annotazioni cliniche sul cholera-morbus e sulle malattie epidemiche e contagiose in generale", Firenze, Ricordi e Compagno, 1835) arrivando a stabilire connessioni tra economia e norme igienico-comportamentali, oggetto di studio di una rinnovata dottrina medica (cfr. "Sulle relazioni della medicina con la pubblica economia", «Atti dei Georgofili », XV, 1837, pp. 73-93). A partire dal 1838, inoltre, ricevette la cattedra di Igiene, terapia e medicina legale, divenendo poi uno dei principali animatori dei congressi degli scienziati (fu segretario della sezione di medicina al congresso pisano e membro di quello fiorentino); partecipò attivamente alle riunioni degli scienziati italiani, in particolare alla prima a Pisa, alla sesta a Milano nel 1844 e alla decima a Siena (1862).
Nel 1843 il Granduca Leopoldo II lo inserì in una commissione incaricata di studiare l'ipotesi di introdurre sul litorale toscano le risaie dal punto di vista della medicina civile; le conclusioni del Puccinotti furono risolutamente contrarie a tale ipotesi, date le conseguenze negative che tale introduzione avrebbe avuto da un punto di vista sanitario; pubblicò i risultati degli studi nel saggio "Sulle risaie in Italia e sulla loro introduzione in Toscana" (1843); tali considerazioni furono alla base del Regolamento sulla cultura del riso in Toscana del 1° settembre 1849. Il 31 ottobre 1855 ottenne dal Granduca una commenda dell'Ordine di Santo Stefano.
Dopo l'Unità lasciò Pisa per trasferirsi a Firenze dove insegnò storia della Medicina presso l'Istituto di Studi Superiori appena costituito, portando a termine la pubblicazione di una "Storia della medicina", opera in tre volumi apparsi per i tipi di Vannini e Giachetti a Livorno dal 1850 al 1866.
Morì a Firenze l'8 ottobre 1872; per i suoi meriti fu sepolto nella Basilica di Santa Croce.